生物反应器应用丨利用木糖加工废液，绿色生产聚苹果酸并回收L-苹果酸

关于聚苹果酸（PMA）

聚苹果酸（PMA）是一种可生物降解的聚酯类高分子材料，由真菌Aureobasidium pullulans产生，易水解释放出单体L-苹果酸（L-MA），L-MA安全无毒,不会对环境造成二次污染。因此，PMA在生物塑料和生物医学领域备受关注。

图1 L-苹果酸结构图

西南大学邹祥教授课题组与西南大学生物技术中心张永军研究员合作，共同在《Chemical Engineering Journal》(IF=16.744) 发表了研究成果“Bio-refinery of xylose processing wastes for green polymalic acid production and L-malic acid recovery by engineered Aureobasidium pullulans in a non-waste-disposal system”。研究利用高浓度木糖母液（WXML），以Na2CO3作为中和剂，在低pH值条件下，于5L发酵罐（保兴赛斯）中高效发酵PMA，最终回收得到高纯度的L-MA结晶。该研究为未来的PMA和L-MA工业生产提供了一种绿色和可持续的常规方法。

图2 研究路线

对A. pullulans的具体研究路线

A. pullulans 的适应性进化 ·

研究人员研究了不同浓度的WXML对ZX-10细胞生长和PMA产量的影响，当WXML浓度为120g/L时，PMA滴度最大，为32.94 ± 0.58 g/L。当WXML浓度超过120g/L时，细胞生长受到抑制，PMA产量也相应下降。研究采用适应性进化方法以进一步提高ZX-10菌株对WXML的耐受性，最终分离出菌株HX-13。当WXML浓度为180g/L时，HX-13的PMA滴度比菌株ZX-10提高了14.24%，达到了46.08 ± 0.15 g/L的最高值，产量提高了7.32%。利用同样的方法增加菌株HX-13对低pH环境的耐受性，获得的菌株AE-35，能在pH值=2.5的条件下生长。在未对pH进行控制的条件下，PMA滴度达到了9.23 ± 0.02 g/L，比菌株HX-13提高了5.27 %。

图3 菌株ZX-10在低pH值和高WXML浓度中的适应性进化

（A）不同浓度WXML对PMA发酵的影响。

（B）菌株ZX-10在WXML中的进化过程。WXML浓度从120g/L增加到300g/L，每梯度增加15g/LWXML。

（C）低pH值（4.6→2.5）下菌株HX-13的进化过程。

（D）HX-13和AE-35菌株在没有控制pH值条件下的发酵。

过表达B.Bassiana的外源cnb基因 ·

钙调素与高度适应性真菌的细胞生长和多重应激耐受性有关，可有效增强其环境应激的耐受性。研究者将B. bassiana的两个钙调素亚基及其同源类似物（cna、cnab和cnb）引入菌株ZX-10，并分别命名为ZX-15、ZX-22和ZX-32。其中，ZX-32的PMA滴度达到14.97 ± 1.46g/L，比菌株ZX-10提高了45.76%；生物量为26.24 ± 1.11 g/L，比ZX-10增加了25.29%。此外，cnb还能通过调节脂质和细胞壁的合成来增强A. pullulans的抗逆性，改善PMA的合成。

图4 评估Ca2+-calcineurin信号途径对加强菌株ZX-10细胞耐受的作用

（A）Ca2+-calcineurin信号途径在ZX-10菌株中的作用

（B）抑制剂（Chl和CsA）对平板中细胞生长的影响

（C）在摇瓶中Chl和CsA对细胞生长和PMA合成的影响

（D）B. bassiana的过表达钙调素基因对细胞生长的影响

（E）B. bassiana的过表达钙调蛋白基因对PMA合成影响

图5 过表达外源cnb对ZX-32菌株细胞生长和代谢的生理反应

（A）外源cnb对Ca2+-calcineurin信号通路关键基因表达水平的影响

（B）通过PI染色观察表达cnb对细胞膜完整性的影响

（C）菌株ZX-10中约10000个细胞的PI染色分布

（D）菌株ZX-32中约10000个细胞的PI染色分布

（E）评估菌株ZX-32在高渗环境中的耐受性

（F）评估菌株ZX-32在低pH环境中的耐受性

低pH环境下发酵 ·

外源cnb的过表达可增强A. pullulans在外部环境下的细胞耐受性，因此，将cnb引入菌株AE-35，得到菌株AE-59。与菌株AE-35相比，菌株AE-59的PMA滴度提高了9.01%，在摇瓶中的产量提高了10.12%。之后，进一步实验比较了在5L发酵罐（保兴赛斯）中，无pH控制和低pH控制模式下的PMA的发酵产量。在无pH控制模式下，pH值从约5.2迅速降至约3.2，WXML中的混合糖在192小时内几乎消耗殆尽，最终PMA为19.25 ± 1.43 g/L。在pH=5.0的条件下，细胞生长速度更快，发酵168h后，PMA滴度达到49.47 ± 0.48 g/L，产量为0.33g/g。

图6 菌株AE-59在5L发酵罐（保兴赛斯）中不同pH值控制模式下的批量发酵

（A）无pH值控制下的批量发酵

（B）通过Na2CO3控制低pH值为5.0时的批量发酵

回收L-MA晶体 ·

除PMA外，发酵液中还含有少量蛋白质、有机酸、无机盐和色素等杂质，必须在下游工艺中去除。研究者设计了DAPC方法以回收L-MA，在这个过程中，L-MA从萃取开始到结束都保留在水相中，最终回收了78.55%的MA，晶体纯度为95.4%，远高于传统的钙沉淀法回收的结果，并且该工艺更加简单、高效和环保。

图7 DAPC法回收L-MA的工艺示意图

图8 DAPC法对L-MA晶体回收情况的高效液相色谱分析结果

END ·

参考文献：

Baiyue Li, Bingqin Li, Pan Wang, Yingying Feng, Xingran Xu, Yongjun Zhang, Xiang Zou. Bio-refinery of xylose processing wastes for green polymalic acid production and l-malic acid recovery by engineered Aureobasidium pullulans in a non-waste-disposal system,Chemical Engineering Journal,Volume 454, Part 4,2023,140533,ISSN 1385-894

BIOTECH-JG/BG系列

研究中使用的5L生物反应器属于保兴赛斯制药装备（上海）有限公司，我们公司提供定制化发酵罐体，可满足多种需求。